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稳转细胞系构建

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稳转细胞系构建

货号:GC1036

品牌:Servicebio

价格:¥3000

规格:

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  简介:

  稳转细胞系构建,基于某一细胞系构建持续过表达或者干?#25293;?#29305;定基因的细胞系。

  外源基因在细胞中的表达可分为两大类,一类是瞬时表达,一类是稳定表达(永久表达)。 前者外源DNA/RNA不整?#31995;?#23487;主染色体中,虽然可以达到高水平的表达,但通常只持续几天。后者外源DNA整?#31995;?#23487;主细胞染色体上,使宿主细胞可长期表达目的基因。

  慢病毒是一种RNA病毒,携带的外源基因在病毒感染细胞后需要逆转录为DNA,再整?#31995;?#23487;主细胞基因组以后?#25293;?#34920;达。利用慢病毒必须整?#31995;?#23487;主基因组的特性来筛选稳定株的方法克服了传统方法的弊端,可以在短时间内获得高效?#23454;?#31283;定细胞株。筛选得到的细胞或者可稳定表达目的蛋白,用于蛋白的扩增?#36879;?#38598;;或者得到稳定沉默特定基因的细胞株。

  慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞,并且在感染后可以整?#31995;?#21463;感染细胞的基因组,进行长时间稳定表达。
 

  实验流程:

  1、细胞培养:细胞复苏、传代、冻存

  2、目的细胞药物筛选浓度确定-通过梯度实验

  使用不同浓度的抗生素对细胞进行处理,筛选出在5-10天内使细胞全部死亡的最低抗生素浓度来进行下一步的筛选试验。不同的细胞?#26434;?#21516;一种抗生素,其筛选浓度不同,而同一种细胞?#26434;?#19981;同的抗生素,其最佳使用浓度也不同。所以在进行稳转株筛选之前,一定要先进行药物浓度筛选预实验以确定最佳药物筛选浓?#21462;?/p>

  3、慢病毒侵染目的细胞

  根据公式计算病毒用量 (细胞数×MOI值/病毒原液滴度)×103=病毒用量(μl)

  4、抗生素筛选细胞左右,使得稳定表达的细胞得以保留。

  5、慢病毒稳转株检测,通过qPCR或者Western Blot检测目的基因

  需要注意的是,mRNA的表达水平可能和蛋白的表达水平不一致,如果需要进一步研究蛋白的功能,可以使用WB检测蛋白的表达水平。
 

  客户提供信息:

  1.目的细胞名称及培养条件

  2.实验目的:过表达或敲低;

  3.慢病毒荧光、抗性、滴度等信息
 

  样本寄送须知:

  1.活细胞:不透气方瓶;

  2. 冻存细胞:纯干冰件,保证干冰充足;

  3. 慢病毒:-80℃ 纯干冰
 

  交付结果:

  实验报告,荧光照片,验证结果
 

  结果展示:



  实验器材展示:
 

Nikon荧光显微镜

生物安全柜

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